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Identifizierung von Protein-Interaktionspartner mit Turbo-ID

Beschreibung

Die Modulation der Ausstattung von Zellmembranen mit unterschiedlichen Rezeptoren und Ionenkanälen spielt eine wichtige Rolle für die Funktion neuronaler Zellen. Eine präzise Regulation des intrazellulären Transports der Membranproteine ist hierbei von grundlegender Bedeutung. Defekte im intrazellulären Transport von Membranproteinen stehen eng im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson.

Um die Entstehung neurodegenerativer Krankheiten besser zu verstehen, ist ein Verständnis des intrazellulären Transportes auf molekularer Ebene essenziell. Hierbei bietet die lichtabhängige Translokation des TRPL-Ionenkanals im Komplexauge von Drosophila ein geeignetes in vivo Modellsystem, um Komponenten des intrazellulären Transports zu identifizieren und zu charakterisieren. Anhand eines EMS-basierten Screens nach TRPL-Translokationsmutanten wurden bereits mehrere Proteine identifiziert, die im Zusammenhang mit der TRPL-Translokation stehen. Ein großer Nachteil des EMS-basierten Mutagenesescreens ist die zufällige Mutation von Genen, wodurch im Anschluss an den Screen eine aufwendige Genkartierung zur Ermittlung der Genloci erfolgen muss. Um diese Problematik zu umgehen, eignet sich das kürzlich entwickelte ts-CRISPR-System sehr gut. Bei diesem System wird über das Gal4-UAS-System die gewebespezifische Expression der Cas9 ermöglicht. Um die TRPL-Translokation im Auge von Drosophila mittels ts-CRISPR zu untersuchen, wurde Cas9 unter dem augenspezifischen Promotor eyeless exprimiert. Mittels Wasserimmersionsmikroskopie lassen sich somit knock-out Fliegen eines Proteins von Interesse nach einem Recyclingdefekt von TRPL untersuchen. Um Proteine von Interesse einzugrenzen gibt es die Möglichkeit Protein-Protein-Interaktionsstudien durchzuführen. Dadurch lassen sich Proteine die mit TRPL interagieren identifizieren und diese können anschließend mittels ts-CRISPR und Fluoreszenzmikroskopie auf eine mögliche Beteiligung im TRPL-Recycling untersucht werden.

Im Rahmen dieses Humboldt Reloaded Projektes sollen mögliche Interaktionspartner von TRPL mittels des Turbo-ID-Systems identifiziert werden. Bei Turbo-ID handelt es sich um ein System in dem eine Biotinligase an dem C-terminus von TRPL gekoppelt ist. Dieses Fusionsprotein wird anschließend in Drosophila exprimiert. Dadurch werden in vivo alle Proteine in einem Radius von 10 nm biotinyliert. Somit können Interaktionspartner von TRPL in vivo über die Biotinylierung identifiziert werden. Als erster Schritt in diesem Projekt werden Fliegen auf Biotin-haltigem Futter gehalten. Anschließend werden die biotinylierten potentiellen Interaktionspartner mittels Streptavidin-Beads aufgereinigt und über eine SDS-PAGE der Größe nach aufgetrennt. Mittels Western Blot werden daraufhin Banden identifiziert die biotinylierte Proteine enthalten. Diese Proteine werden im finalen Schritt des Projektes durch Massenspektrometrie identifiziert.

Projektzeitraum

Sommersemester 2024

Bewerbungszeitraum

01. bis 14.04.2024

Durchführung

semesterbegleitend

Studienfach

Agrarbiologie
Agrarwissenschaften
Biologie
Biologie - Lehramt
Ernährungswissenschaft
Lebensmittelchemie
Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie

Betreuende

Matthias Zeger

Institut

Institut für Biologie (190) (190f)

Sprache

deutsch/englisch

Teilnehmendenanzahl

min. 1, max. 2

Arbeitsaufwand

ca. 180 Stunden pro Teilnehmende:r | 6 ECTS-Punkte

Arbeitsaufwand (Stunden und ggf. ECTS) sind ungefähre Angaben. Die tatsächlich vergebenen ECTS-Punkte ergeben sich aus der tatsächlich geleisteten Arbeit.

 

Für dieses Projekt ist kein Motivationsschreiben des Studierenden erforderlich

Projektart

experimentell

Lernziele

Die Teilnehmende lernen in diesem Projekt:

Die Teilnehmer/innen lernen in diesem Projekt:

• Grundlagen zum Transport von Membranproteinen
• Grundlagen Protein-Protein-Interaktion
• Proteintransport-Defekte und neurodegenerative Erkrankungen
• Turbo-ID-System
• SDS-PAGE und Western Blot Analyse
• Massenspektrometrie
• Grundlagen wissenschaftlichen Arbeitens (Planung und Durchführung von Experimenten, Auswertung der Daten, Darstellung von Ergebnissen in Form eines Projektposters und eines Abstracts)

Anmerkungen für Studierende

Schlagworte

Drosophila, Turbo-ID, Protein-Protein-Interaktion, TRPL, Massenspektrometrie, SDS-PAGE